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科赫在纯培养条件下繁殖了数代炭疽菌，当他将这繁殖了很多代后的炭疽菌接种到小鼠身上的时候，小鼠仍然感染了炭疽病。

1876 年，科赫公开了他的发现。他去了弗罗茨瓦夫，进行了3天的公开表演实验。他证明了炭疽杆菌是炭疽病的病因，首次提出了炭疽杆菌的生活史，即杆菌—芽孢—杆菌的回圈，而能在土壤中长期生存的芽孢，就是造成炭疽大流行的罪魁祸首。

同时，他还提出了他对病原微生物的观点，他认为每种疾病都有特定的病原菌，而不是像人们之前所认为的，所有细菌都是一个种。科赫的报告引起了微生物学界的震动，这是人们第一次证明一种特定的细菌是引起一种特定传染病的病因，科赫的报告开启了科学家们关于病原微生物研究的时代。

发现炭疽杆菌并不是科赫事业的终结，只是他辉煌事业的开端。1880年，科赫应邀赴柏林工作，出任德国卫生署研究员。在这里，他终于有了良好的实验设备和研究助手，他创造了至今还在普遍使用的经典细菌培养法—悬滴法，他用不同的染液给细菌染色，给显微镜加上了照相机，显微摄影术的出现让人们可以透过照片清楚地看到显微镜下的世界，终结了仅凭肉眼观察、文字描述或手绘图案定义细菌而引发的争议与混乱。

然而，一个至关重要的问题始终没有得到解决，人们仍然不知道，应该如何从许多混杂在一起的细菌中分离出纯种的细菌。细菌是会活动的生物，当它们在培养液中游走的时候，是几乎不可能分离出纯种细菌的。想明白了这点的科赫知道，只有用固体培养基才能得到纯种细菌。他将琼脂加到了传统的肉汤培养基中，首创了肉汤琼脂固体培养基。到今天，这仍然是细菌分离的重要工具。

科赫做了关于纯种细菌培养的报告和示范，当时的微生物学权威巴斯德评价道，“这是一项伟大的进展”。

19 世纪，肺结核被称为“白色瘟疫”，在当时的死因中占据前列，可人们无论是对死者进行病理解剖还是动物实验，都没办法找到致病菌。传统的方法在肺结核面前失去了效果，人们束手无策，只能坐以待毙。

当时有很多科学家为寻找肺结核的致病菌绞尽脑汁，科赫自然也不例外。科赫意识到，特殊的感染一定是由特殊的微生物引起的，只有找到那个微生物，将其分离培养出来，才有进一步研究的可能性。

于是，科赫用各种染料给病灶组织染色，结晶紫、美蓝、伊红、刚果红……常用的染料科赫都试了个遍，却仍然一无所获。虽然有些失落，但是科赫没有放弃寻找合适的染料。终于，在亚甲基蓝染色后的组织中，他发现了一种从未见过的细菌。

为了验证自己的实验结果，他在柏林的各个医院中寻找因结核病致死的患者遗体，拿到了大量病灶组织的他继续着自己的实验。他将结核组织注射到各种动物体内并进行染色观察。结果让他十分兴奋，所有患上结核病的动物体内都能看到那种细菌。而健康的动物体内，完全找不到那种细菌的踪影。